用于蛋白质表达的系统和方法与流程

2.本技术要求于2019年9月16日提交的美国临时专利申请序列号62/901,043和2020年2月5日提交的美国临时专利申请序列号62/970,628的权益,各专利申请的内容出于所有目的,通过引用将其全文并入本文。

4.以电子方式提交的文本文件的内容通过引用的方式整体并入本文:序列表的计算机可读格式副本(文件名:exci_001_02wo_seqlist_st25.txt,记录日期为2020年9月15日,文件大小84.8kb)。

5.在培养中生长的真核细胞中蛋白质的重组表达在科学研究和医学中具有多种应用。重组产生的蛋白质(如抗体、酶、g蛋白偶联受体(gpcr)、分泌蛋白、离子通道、病毒蛋白和生长因子)用于制药工业开发新药(例如,发现小分子),作为治疗剂(例如、抗体和其他生物药物),并作为分析方法的关键资产。除了在制药工业中的用途外,重组生产的哺乳动物蛋白质也越来越多地用于食品工业(例如,用于所谓的清洁肉类生产)。对于许多重组蛋白质来说,实现以功能形式的重组蛋白质表达仍然具有挑战性。

7.本发明人已经认识到,某些增强子蛋白与靶蛋白的共表达改善重组产生的蛋白质。在多种实施方案中,所公开的组合物和方法表现出优于现有技术的一个或多个以下优点:(1)它们增加细胞系(例如,真核细胞系)内靶蛋白的蛋白质表达(产量);(2)它们控制靶蛋白表达的调节;(3)它们表达表现出改善特性的靶蛋白(例如,降低的错误折叠、改变的活性、不正确的翻译后修饰和/或毒性);(4)它们增加重组蛋白的正确折叠和/或高产量;(5)它们改善下游激活通路的性能(例如,gpcr信号传导);和/或(6)增强子蛋白的共表达不影响靶蛋白的功能和/或细胞的下游代谢。本发明不受这些列举的优点的限制,因为一些实施方案没有表现出这些优点、表现出这些优点的一些或全部。

8.在一个方面,本公开提供了一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统,其包含一个或多个载体。多个载体(或一个载体)具有编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。增强子蛋白是核质转运蛋白(nct)的抑制剂,和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(l)蛋白、小核糖核酸病毒2a蛋白酶、鼻病毒3c蛋白酶、单纯疱疹病毒(hsv)icp27蛋白和弹状病毒基质(m)蛋白。第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

9.在另一个方面,本公开提供了用于表达靶蛋白的真核细胞,其中所述细胞包含编码增强子蛋白的外源多核苷酸。增强子蛋白是核质转运蛋白(nct)的抑制剂,和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(l)蛋白、小核糖核酸病毒2a蛋白酶、鼻病毒3c蛋白酶、冠状

病毒orf6蛋白、埃博拉病毒vp24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(veev)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(hsv)icp27蛋白和弹状病毒基质(m)蛋白。外源多核苷酸可操作地连接至启动子(任选地天然启动子或外源启动子)。在又一方面,本公开提供了一种用于重组表达靶蛋白的方法,所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸引入该真核细胞中,该多核苷酸与启动子可操作地连接。在又一方面,本公开提供了一种用于重组表达靶蛋白的方法,所述方法包括将本公开的载体系统引入真核细胞中。在又一方面,本公开提供了通过将本公开的载体系统(或载体)引入真核细胞中产生的细胞。在又一方面,本公开提供了通过将本公开的载体系统(或载体)引入真核细胞中表达的蛋白质。在又一方面,本公开提供了一种在真核细胞中表达靶蛋白的方法,所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸(所述多核苷酸与启动子可操作地连接)引入真核细胞中。该方法利用增强子蛋白的共表达来增强靶蛋白的表达水平、溶解度和/或活性。增强子蛋白是核质转运蛋白(nct)的抑制剂,和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(l)蛋白、小核糖核酸病毒2a蛋白酶、鼻病毒3c蛋白酶、冠状病毒orf6蛋白、埃博拉病毒vp24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(veev)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(hsv)icp27蛋白和弹状病毒基质(m)蛋白。

10.在另一个方面,本公开提供了产生针对靶蛋白的抗体的方法,所述方法包括用使用本公开的系统或方法产生的细胞或靶蛋白免疫受试者。在又一方面,本公开提供了一种通过细胞分选发现抗体的方法,所述方法包括提供溶液以及重组细胞群,其中所述溶液包含使用本公开的系统或方法产生的标记细胞或标记靶蛋白,所述重组细胞表达多肽文库,每个多肽文库包含抗体或其抗原结合片段;通过检测与标记细胞或标记靶蛋白结合的重组细胞,从溶液中分选一个或多个重组细胞。在另一方面,本公开提供了一种淘选噬菌体展示文库的方法,所述方法包括将噬菌体展示文库与使用本公开的系统或方法产生的细胞或靶蛋白混合;以及纯化和/或富集结合细胞或靶蛋白的噬菌体展示文库的成员。

11.进一步的方面和实施方案由随后的详细公开提供。本发明不受此概述的限制。

13.图2a-2y是非限制性说明性构建体的示意图:eg1,图2a;eg2,图2b;eg3和eg4,图2c;eg5,图2d;eg6,图2e;eg7,图2f;eg8,图2g;eg9,图2h;eg10和eg11,图2i;eg12和eg4,图2j;eg10,图2k;eg13,图2l;eg14,图2m;eg15,图2n;eg16,图2o;eg17,图2p;eg18,图2q;eg19,图2r;eg20,图2s;eg21,图2t;eg22,图2u;eg23,图2v;eg24,图2w;以及eg25,图2x。

14.图3a-3d显示了与对照载体eg1相比,使用构建体eg2(cmv-gfp-ires-l)表达的表达gfp的细胞的光学和荧光显微镜图像。图3a:包含eg1的细胞的光学显微镜。图3b:包含eg1的细胞的荧光显微镜。图3c:包含eg2的细胞的光学显微镜。图3d:包含eg2的细胞的荧光显微镜。来自eg2构建体的荧光gfp蛋白的表达证明了该系统的可行性。与包含eg1的细胞(图3b)相比,包含eg2的细胞(图3d)中有害过表达的降低证明了通过引入l-蛋白改善了对gfp表达的调节。图3a-3d中的条代表400微米。

15.图4a-4d显示了与对照载体eg1相比,使用构建体eg3和eg4(分别为t7-ires-l-gfp和cmv-t7)表达的表达gfp的细胞的光学和荧光显微镜图像。图4a:包含eg1的细胞的光学显微镜。图4b:包含eg1的细胞的荧光显微镜。图4c:包含eg3+eg4的细胞的光学显微镜。图4d:

包含eg3+eg4的细胞的荧光显微镜。来自eg3+eg4构建体的荧光gfp蛋白的表达证明了该系统的可行性。与包含eg1的细胞(图4b)相。

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