新型冠状病毒及其疫苗的全面解读

蛋白是一种体积较大的多功能跨膜蛋白,在病毒吸附,融合,注入宿主细胞过程发挥重要作用。

1、S蛋白由S1和S2亚基构成,每个亚基可进一步分成不同功能结构域。S1亚基有NTD和RBD 2个结构域,RBD中含有保守的RBM。S2亚基有FP、HR1和HR2 3个结构域。S1亚基排布在S2亚基顶端形成免疫显性S蛋白。

病毒利用宿主跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)和内体半胱氨酸蛋白酶CatB/L进入细胞。TMPRSS2负责S蛋白的裂解,以暴露S2亚基的FP区,该亚基负责启动内体介导的宿主细胞进入。表明TMPRSS2是病毒进入所必需的宿主因子,因此,使用抑制这种蛋白酶的药物可以达到治疗目的。

SARS-CoV-2通过S蛋白与人hACE2结合靶向细胞。冠状病毒通过构象掩蔽和糖屏蔽使S蛋白逃脱免疫系统攻击。冷冻EM揭示S蛋白外结构域三聚体具有开放和关闭2种构象,这种构象变化对与hACE2结合至关重要,因为三聚体开放可以暴露RBM。

2、E蛋白形成E通道,在病毒复制周期中发挥多种功能,包括整合、释放、致病机制等。这些离子通道以同源五聚体形式存在,每个亚基含有50-120个氨基酸。E通道含有至少1个TMD,这有利于与宿主细胞膜连接。

3、在病毒颗粒中,M蛋白是中心组织者,通过与必需的结构蛋白相互作用,在SARS-CoV-2的形态发生和组装中起着至关重要的作用。M和N蛋白的结合稳定了N蛋白和RNA复合物,以及病毒的内部核心。在SARS-CoV中,M蛋白也被证明能诱导宿主细胞凋亡。N蛋白具有稳定病毒粒子ssRNA的作用,是抗病毒RNAi拮抗剂,也负责抑制宿主细胞进入S期(DNA合成期)。

疫苗开发需要谨慎的验证和不良反应评估。疫苗目标人群包括60岁以上的高危人群(特别是患有慢性病的人),一线医疗工作者和从事必需品行业的人。S蛋白是制备疫苗的主要抗原,其中和血清可为机体提供保护。SARS-CoV-2全长5500基因组已在NCBI发布,为疫苗研发提供基础。截止2020年7月2日,全球已有158个SARS-CoV-2候选疫苗,其中135个处于临床前或研发阶段。疫苗开发的平台包括蛋白亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗(DNA、RNA)、减毒活疫苗和被动免疫,每种疫苗都有各自的优势与劣势。

该类疫苗通常低免疫原性,需要配合佐剂使用才能诱导免疫。佐剂增强了抗原物质的生物半衰期或改善了免疫调节细胞因子,弥补了亚单位疫苗的缺陷。SARS-CoV-2S蛋白是诱导中和抗体最合适的抗原。病毒通过S蛋白与hACE2受体介导的内吞作用进入细胞。S糖蛋白具有构象变化,因此,为了更好的诱发抗体反应应该保留其抗原结构和构象。

NVX-CoV2373是基于融合前S蛋白的重组纳米疫苗。该蛋白由杆状病毒稳定表达,设计使用Matrix-M佐剂增强免疫效果。动物实验中,单次免疫即可获得高水平抗体,可阻断SARS-CoV-2与hACE2受体结合。

一款rSARS-CoV-2 S1和rSARS-CoV-2-S1fRS09组分的微针剂配方。在临床前实验小鼠模型中,接种2周后,可检测到具有统计学意义的抗体。而且,该疫苗免疫原性在经过γ射线无菌处理后仍然保留。强化免疫前,即可获得具有统计学意义的抗体水平使该疫苗具有可行性。

一款由酿酒酵母表达平台(D-Crypt TM)共表达SARS-CoV-2重组S、M、E的多抗原病毒样颗粒,其有望进入临床前试验。

病毒载体疫苗可长期提供高水平抗原蛋白表达,诱导CTLs,最终清除病毒感染。

一款由重组、复制缺陷5型腺病毒(Ad5)载体表达的SARS-CoV-2重组刺突蛋白的疫苗。将优化的全长S蛋白基因连同血浆酶原活化信号肽基因载入E1和E3缺失的Ad5载体中。该疫苗由源自MicrobixBiosystem的Admax系统构建。I期临床实验中,免疫后14天RBD(S1亚基受体结合域)和S蛋白中和抗体增强4倍,在28天达到高峰。免疫后14天CD4+T、CD8+T细胞达到高峰。已经存在的Ad5免疫抗性部分限制了抗体和T细胞反应。本研究将进一步在18-60年龄段人群中进行,接受1/3研究剂量,免疫后随访3-6个月。

M2SR是一种自限型流感病毒,在其中插入SARS-CoV-2刺突蛋白基因序列制备疫苗。该疫苗还可表达流感病毒血凝蛋白,诱导双重免疫反应。M2SR由于缺少M2基因无法实现复制,但可以进入细胞,诱导免疫反应。可通过鼻内(模仿自然感染模式)免疫,活化多种免疫系统模式,与肌肉注射比较,可获得高水平免疫效果。

使用SMENP minigenes实现表达SARS-CoV-2结构蛋白和蛋白酶保守结构域的慢病毒感染工程化树突状细胞,得到LV-SMENP-DC疫苗。皮下免疫激活CTLs。

经过密码子优化的SARS-CoV-2 S蛋白编码序列,在其5’末端引入组织血浆酶原活化(tPA)先导序列,克隆至穿梭质粒。该穿梭质粒在Gateway重组克隆位点间编码人类巨细胞病毒(IECMV)的主要早期基因,以及四环素操作(TetO)位点和牛生长激素(BGH)多腺苷酸信号。将SARS-CoV-2S基因插入ChAdOx1腺病毒基因组的E1位点,病毒在T-Rex293HEK(人胚胎肾293)细胞系中繁殖,通过CsCl梯度超速离心纯化。临床前试验中,肌内接种动物实验表现良好免疫反应。该疫苗已进入二期临床试验,增大样本评估数量。

mRNA疫苗不具感染性,没有插入突变风险。包括非复制RNA和病毒驱使自复制RNA。通过优化可增强mRNA的疫苗稳定性,降低载体免疫原性,避免抗载体免疫,实现可重复免疫。该平台增强了快速疫苗开发的能力,具有设计灵活性以及模仿自然感染过程的优点。

编码SARS-CoV-2全长,融合前刺突蛋白的mRNA包裹入脂纳米颗粒形成mRNA-1273疫苗。其可诱发高水平S蛋白特异性抗病毒反应。也可由灭活抗原或亚单位抗原组成。该疫苗被FDA迅速批准,已进入II期临床试验。公司已经公布接受不同免疫剂量的8位受试者的抗体数据。25ug剂量组获得了类似康复期抗体水平的效果。而100ug剂量组,超过了康复期抗体水平。在25ug和100ug剂量组疫苗基本安全和耐受,而250ug剂量组出现了3级系统症状不良反应。

BNT162b1是编码SARS-CoV-2密码子优化RBD三聚体mRNA疫苗。由于在RBD抗原中加入T4纤维蛋白衍生折叠三聚体结构,增强了疫苗的免疫原性。mRNA包裹在80nm可离子化阳离子脂纳米颗粒。

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