禽流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用

2.流行性感冒病毒(influenza virus),简称流感病毒。是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的代表种,包括人流感病毒和动物流感病毒,人流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型,是流感的病原体。

3.流感病毒是一种负链rna病毒,包含编码至少12种蛋白质的八个rn段(pb2,pb1,pb1-f2,pa、pa-x、ha、na、np、m1、m2、ns1和ns2)。其中两种蛋白质,血凝素(ha)和神经氨酸酶(na),是细胞表面糖蛋白,使病毒能够分别进入(通过受体结合和膜融合)和逃离宿主细胞;由于ha和na容易在传播过程中发生突变,导致免疫原性发生改变,所以根据的ha和na抗原性区别,流感病毒又可以分为不同的亚型,例如h1n1、h5n1、h3n2等。

4.ha是病毒颗粒的主要表面抗原,也是病毒中和抗体(abs)的主要目标,ha是一种合成为单个多肽链(hao)的同源三聚体,随后被宿主细胞蛋白酶切割以达到具有融合能力的状态。因此,成熟的ha三聚体由ha1和ha2亚单位组成,它们在切割后通过一个二硫键保持交联。ha三聚体可分为两个结构和功能域,头部和茎,分别包括受体结合位点和融合机制。ha1亚单位形成膜远端的球状头部和膜近端茎部区的一部分。ha2亚单位代表茎部区的主要成分。ha的头部介导受体结合,而ha2亚单位代表茎部区是介导膜融合作用的主要部分。中和抗体反应主要针对ha的免疫显性结构域。然而,由于头部区域表位的高度遗传可塑性,抗体反应是毒株特异性的,缺乏与不同ha亚型的广泛交叉反应性。相比之下,ha茎部的序列和结构在不同的流感亚型中更加保守,广泛中和该结构域的抗体被认为是对抗各种流感病毒株的潜在方法。虽然不同亚型的ha氨基酸序列存在差异,但是其ha1的氨基酸数量及空间结构具有很强的保守性,通过结构生物学解析的不同亚型ha比较我们发现,其空间结构基本一致。

5.最保守的ha茎部区之一是55个氨基酸长的d螺旋(lah)。已有研究表明,在体外表达的lah能够自发组装成为可溶性的三聚体蛋白复合物,这也和ha在病毒表面形成天然三聚体有紧密的联系。利用这一特点,可以将lah与重要病毒抗原蛋白融合,形成依赖于lah的三聚体可溶蛋白,提高抗原的免疫原性。

6.目前,病毒疫苗的种类主要包括:灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒疫苗。灭活疫苗:灭活疫苗是传统的经典技术路线,即在体外培养病毒,然后将其灭活,使之没有毒性。灭活疫苗的优点是制备方法简单快速,安全性比较高,但灭活疫苗也有缺点,如接种剂量大、免疫期短,最可怕的缺点是有时候会造成抗体依赖增强效应(ade),使病毒感染加重。腺病毒载体疫苗:腺病毒载体疫苗是用经过改造后无害的腺病毒作为载体,装入病毒的表面重要蛋白基因,制成腺病毒载体疫苗,刺激人体产生抗体,优点是安全、高效、引发的不良反应少;缺点是重组病毒载体疫苗以5型腺病毒作载体,但绝大多数人成长过程中曾感染过5型腺病毒,体内可能存在能中和腺病毒载体的抗体,降低疫苗效果。核

酸疫苗:核酸疫苗包括mrna疫苗和dna疫苗,是将编码表面蛋白的基因,mrna或者dna直接注入人体,利用人体细胞在人体内合成表面蛋白,刺激人体产生抗体。核酸疫苗的优点是研制时不需要合成蛋白质或病毒,流程简单,安全性相对比较高;缺点是无成功先例。减毒疫苗:是用已批准上市的减毒流感病毒疫苗作为载体,携带病毒表面蛋白,共同刺激人体产生针对两种病毒的抗体;由于减毒流感病毒容易感染鼻腔,所以这种疫苗仅通过滴鼻的方式就可以完成疫苗接种。重组蛋白疫苗:也称基因工程重组亚单位疫苗,是通过基因工程方法,大量生产病毒最有可能作为抗原的表面蛋白,把它注射到人体,刺激人体产生抗体;重组亚单位疫苗的优点是安全、高效、可规模化生产;比较成功的基因工程亚单位疫苗是乙型肝炎表面抗原疫苗。

7.本发明针对禽流感病毒,我们依据流感病毒ha蛋白的天然三聚体结构,以及亚单位疫苗的优势,设计了三聚体形式的流感病毒亚单位疫苗;该疫苗是使用昆虫细胞体外表达流感病毒h1n1 ha2蛋白三聚体形成区域lah在n端、h7n9 ha1或h5n1 ha1蛋白在c端的融合三聚体蛋白h7n9 ha1c-trimer、h5n1 halc-trimer,且与各自单体蛋白(h7n9 ha1-monomer、h5n1 ha1-monomer)相比,三聚体蛋白的免疫效果更好,能够使小鼠产生更高滴度的针对流感病毒ha1的特异性抗体。本发明的三聚体形式ha1克服了ha1单体免疫原性不足的缺点,大大提高了小鼠针对流感病毒ha1的特异性抗体的水平。所以,本发明的三聚体疫苗具有优异的免疫原性,为针对流感病毒疫苗的设计提供了一种全新的形式。

11.流感病毒a/california/07/2009 h1n1 ha蛋白三聚体形成区lah k403-n474,其氨基酸序列为seq id no:1;

12.以及流感病毒h7n9 ha1区,所述流感病毒h7n9 ha1区与a/shanghai/2/2013 h7n9 ha1区d18-s340的氨基酸序列同源性大于90%,例如大于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或等于100%,且存在差异的位点在流感病毒h7n9 ha1区的loop区,所述流感病毒h7n9 ha1区例如选自:

13.a/shanghai/2/2013 h7n9 ha1区d18-s340,其氨基酸序列为seq id no:2,

14.或a/anhui/1/2013 h7n9 ha1区d18-s340,其氨基酸序列为seq id no:3,

15.或a/guangdong/17sf003/2016 h7n9 ha1区d18-s340,其氨基酸序列为seq id no:4,

16.或a/hong_kong/125/2017 h7n9 ha1区d18-s340,其氨基酸序列为seq id no:5;或

18.流感病毒a/california/07/2009 h1n1 ha蛋白三聚体形成区lah k403-n474,其氨基酸序列为seq id no:1,

19.以及流感病毒h5n1 ha1区,所述流感病毒h5n1 ha1区与a/indonesia/5/2005 h5n1 ha1区d18-e341的氨基酸序列同源性大于90%,例如大于90%、91%、92%、93%、

94%、95%、96%、97%、98%、或等于100%,且存在差异的位点在流感病毒h5n1 ha1区的loop区,所述流感病毒h5n1 ha1区例如选自:

20.a/indonesia/5/2005 h5n1 ha1区d18-e341,其氨基酸序列为seq id no:6,

21.或a/hong kong/156/97 h5n1 ha1区d18-e34。

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