Nature:新冠病毒刺突蛋白的结构和分布

新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β冠状病毒属,是一种包膜病毒,含有较大的由核衣壳蛋白(N)包裹的正义RNA基因组。三个跨膜蛋白被整入病毒脂质包膜:刺突蛋白(S)和两个较小的蛋白,即膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)。当通过低温电镜(cryo-EM)成像时,β冠状病毒呈近似球形颗粒,直径在100纳米上下浮动,内含致密的病毒质(viroplasm),由突脂质双层包围着,S蛋白三聚体(下称S三聚体)从脂质双层中突出。SARS-CoV-2的S三聚体结合到靶细胞表面上的受体ACE2,并介导随后的病毒摄取和融合。在这样做的过程中,S蛋白经历了显著的结构重排,从融合前的构象切换到融合后的构象。S蛋白融合前和融合后的整体结构在冠状病毒中是非常保守的。

在感染过程中,冠状病毒广泛地重塑细胞的内部膜结构,产生病毒复制细胞器以便在其中进行病毒复制。S蛋白,连同蛋白M和E,入到内质网(ER)的膜中,并被运送到内质网-高尔基体中间区室(ER Golgi intermediate compartment, ERGIC)。封装的基因组出芽到ERGIC中以形成病毒颗粒,随后将病毒颗粒运送到质膜并释放出去。S蛋白是通过先在S1/S2位点随后在S2位点进行蛋白酶切割,从而为膜融合做好准备。

包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒的S蛋白融合前结构已通过可溶性的分泌形式的S蛋白异位表达,随后进行纯化和cryo-EM成像,得到了广泛研究。在S蛋白融合前结构中,受体结合结构域(RBD)位于融合核心(fusion core)上方的一个较宽的S三聚体刺突结构的顶部。在含有三个RBD的S三聚体中,每个RBD被一个显示出一定流动性的N端结构域(NTD)包围着。在封闭的融合前结构中,所有三个RBD平铺在刺突结构表面上,在很大程度上封闭了受体结合位点,而在开放的融合前结构中,一个或多个RBD向上抬起,从而暴露受体结合位点。S三聚体的表面发生广泛的糖基化,每个S蛋白单体有22个潜在的N-糖基化位点。在结合受体ACE2后,从融合前到融合后的结构转变让S蛋白的融合肽和跨膜结构域聚集在一个以三螺旋束为中心的长针状结构的一端。五个N连接的聚糖沿融合后的S三聚体刺突结构的长度间隔分布。

充分理解S蛋白如何发挥作用,以及它们如何与免疫系统相互作用,需要了解病毒颗粒内S三聚体的结构、构象和分布。在一项新的研究中,来自英国医学研究理事会分子生物学实验室和德国海德堡大学的研究人员利用cryo-EM方法研究了S三聚体在病毒颗粒表面上的结构、构象和分布。相关研究结果于2020年8月17日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions”。

为了避免与病毒浓缩或纯化相关的伪影(artefacts),这些作者想要在不浓缩或纯化病毒的情形下对来自感染细胞的上清液的SARS-CoV-2病毒进行成像。利用SARS-CoV-2(病毒分离株Germany/BavPat1/2020)感染VeroE6细胞。在感染48小时后,上清液经澄清后用甲醛固定灭活,并在-80℃下储存。蛋白印迹法(Western blot)显示,病毒颗粒上大约45%的S蛋白单体在多精氨酸切割位点上切割成S1和S2(图1a)。固定的上清液通过骤冻玻璃化,并通过cryo-EM成像。固定可能有助于通过交联让一些蛋白构象稳定化,但预计不会产生任何新的构象。正如预期的那样,考虑到细胞上清液中病毒的浓度(约107个噬菌斑形成单位/ml, PFU/ml),他们发现少量的病毒颗粒分散在网格周围—这些病毒颗粒通过低温电子断层扫描(cryo-electron tomography, cryo-ET)成像(图1b)。

SARS-CoV-2病毒颗粒是近似球形的,到脂质双层外边缘的直径为91±11纳米(n = 179)。它们含有与N蛋白相对应的颗粒状密度,并缀有S三聚体(图1b,c)。这些特征与利用cryo-EM成像的其他冠状病毒的特征基本一致。从这种病毒表面上突出的S三聚体有两种形态–少数是延长的薄结构,这让人联想到融合后的构象,而大多数是更宽的结构,这让人联想到融合前的构象。这一观察结果与近期在预印本服务器上发表的一份论文(bioRxiv, 2020, doi:10.1101/2020.03.02.972927)—该论文显示了用核酸修饰剂β-丙内酯灭活的纯化SARS-CoV-2病毒的cryo-EM图像,在该图像中仅在病毒表面上观察到薄薄的突起—形成了鲜明的对比,但与原位观察到的病毒组装相一致。

这些作者还收集了SARS-CoV-2感染CALU-3细胞后产生的病毒颗粒的断层扫描图,其中Calu-3细胞是一种人肺癌细胞系,在病毒感染上产生的病毒滴度与VeroE6细胞相当。CALU-3细胞产生的这些病毒颗粒的形态和S三聚体在病毒颗粒表面上的外观与从VeroE6细胞产生的病毒颗粒所观察到的相一致。蛋白印迹分析表明,约73%的S蛋白为裂解形式。

SARS-CoV-2病毒颗粒含有24±9个S三聚体。这个值低于之前假设S蛋白等距离分布的估计值,这是因为S蛋白在病毒表面分布不均匀。一小群病毒颗粒仅含有很少的S三聚体,而较大的病毒颗粒则含有更多的S三聚体。这些作者从179个病毒颗粒中鉴定出4104个宽的S三聚体和116个薄的S三聚体,并对它们进行子断层扫描图平均化(subtomogram averaging)。平均化的结构,在7.7和22埃的分辨率下,分别非常好地对应于之前公布的纯化S三聚体在融合前和融合后形式下的结构(图2a)。总体而言,约97%的S三聚体是融合前形式,3%是融合后形式。融合前和融合后的S三聚体形式似乎是均匀地分布在病毒颗粒中。

病毒表面上的融合前S三聚体可能主要处于封闭构象,它的开放构象可通过ACE2结合诱导或稳定化,或者它在融合前也可能存在开放构象。当用作免疫原时,开放或封闭的构象可诱导不同范围的抗体,目前人们正在努力产生稳定在其中一种构象的S蛋白构造体。

为了评估S三聚体是否存在于开放和/或封闭的构象,这些作者对S三聚体中的S蛋白单体的RBD区域进行分类。他们发现三种类型:RBD处于封闭位置的S蛋白;RBD处于开放位置的S蛋白;RBD以封闭位置为主但密度有所减弱的S蛋白,这表明存在更多的可移动构象。

考虑到每个S蛋白单体被分配到的类型,这些作者推导出完全封闭的S三聚体结构,以及其中一个RBD是开放的S三聚体结构,这两者分别代表了3854个融合前S三聚体中的约31%和约55%(图2b)。他们还发现了少量S三聚体(3854个融合前S三聚体中的约14%)的两个RBD处于开放构象(图2b)。这些观察结果证实在重组S三聚体中观察到的RBD的开放也发生在病毒表面上,并且稳定在封闭和开放构象中的人工S蛋白构造体都代表了原位存在的结构。因此,这种受体结合位点在原位随机暴。

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